TaqMan^® Real-time RT-PCR stellt die neueste Generation der Expressionsanalyse dar. Dabei werden PCR-Primer mit einer genspezifischen TaqMan^®-Sonde kombiniert. Diese ist mit einem Reporter-Fluoreszenzfarbstoff (FAM oder VIC) am 5´-Ende und einem Licht absorbierenden sogenannten Quencher (z.B. TAMRA) am 3´-Ende modifiziert. Das Quencher-Molekül absorbiert die vom benachbarten Reporter freigesetzte Energie und reduziert so die von der Sonde emittierte Fluoreszenz. Während der Annealing-/Extensions-Phase der PCR bindet die TaqMan^®-Sonde an das Template und wird durch die 5´-3´-Exonukleaseaktivität der Taq DNA-Polymerase gespalten. Dabei geht die räumliche Nachbarschaft zwischen Reporter und Quencher verloren, was unmittelbar zu einer Erhöhung der Fluoreszenz führt (s. Abbildung).
Mit dem ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) kann diese Fluoreszenz in Echtzeit gemessen werden. Die Zunahme der Reporter-Fluoreszenz ist proportional zur Menge des neu gebildeten PCR-Produkts. Aus dem Kurvenverlauf kann die initial eingesetzte Matrizenmenge errechnet werden, was eine quantitative Detektion mit einer Sensitivität von bis zu 5 Molekülen erlaubt.

         
      

Hintergrund-Information

Im Vergleich zu konventionellen Methoden (Northern Blot, RNase Protection Assay, etc.) bietet dieses Verfahren entscheidende Vorteile:

 hohe Reproduzierbarkeit durch Standardisierung
 größtmögliche Sensitivität (Detektionsgrenze: bis zu 5 mRNA Moleküle)
 geringe Ausgangsmenge an RNA nötig (10 - 50 ng Gesamt-RNA/Reaktion)
 hoher Probendurchsatz durch 96-well Format

Typische Anwendungen von TaqMan^® Real Time RT-PCR

• Validierung von Ergebnissen aus Microarray-Expressionsanalysen
• Expressions-Profiling von spezifischen mRNAs in verschiedenen Geweben
• mRNA Expressions-Muster in kleinsten Zellmengen
• mRNA Expressions-Muster in Primärzellen
• mRNA Expression bei Wirkstoff-Studien in Zellkultur

Service

• Entwicklung und Etablierung genspezifischer TaqMan^®-Assays
• Bestimmung optimaler Referenz(Housekeeping)-Gene für individuelle Expressionsanalyse
• Messung von etablierten TaqMan^®-Assays in 20 Geweben von Maus und Mensch (Tissue Panel)
  

Darüber hinaus besteht die Möglichkeit einer reinen ABI PRISM 7000 Gerätenutzung. Hierbei reserviert der Kunde Messzeit und bringt zum vereinbarten Zeitpunkt die bereits fertig pipettierte Mikrotiterplatte ins KFB.

The PCR process and 5' nuclease process are covered by patents owned by members of the Roche Group. ABI PRISM is a registered trademark of PE Corporation. TaqMan^® is a trademark of a member of the Roche Group. All other trademarks are properties of their respective owners.